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　　摘　要：狂犬病是感染中枢神经系统的一种人兽共患的急性接触性传染病，由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起，病毒粒子聚集形成胞浆内包含体，只在神经细胞胞浆和蒲肯野氏细胞里存在。RV可分成4个血清型和2个尚待定型的病毒株。随着RV血清型变异，目前人用和动物用狂犬病疫苗毒株已不能提供针对所有种类RV的有效保护，为了对狂犬病及其研究进展有一个全面的认识，该文主要对RV病原以及狂犬病疫苗等方面的研究进展进行了综述。

　　关键词：狂犬病病毒；复制；疫苗

　　狂犬病(Rabies)是一种感染中枢神经系统的古老的病毒病，是由狂犬病病毒引起的一种人兽共患的急性接触性传染病，是危害人及家畜的主要传染病之一，引起急性脑脊髓炎，一旦有症状出现，几乎100%致死[1]。病毒主要存在于感染动物的唾液里，可以通过狂暴动物咬伤、抓伤、舔吮传播，由于它可穿过黏膜，因此也可通过气溶胶传播。狂犬病首次报道于1709年发生在墨西哥。1885年Pasteur L第一次分离出狂犬病病毒(Rabies virus，RV)，并研制出狂犬病疫苗。随着RV血清型变异，目前人用和动物用狂犬病疫苗毒株已不能提供针对所有种类RV的有效保护[2]。因此，为评价现有疫苗的适用性以及制定根除狂犬病的正确战略，需要对狂犬病及其疫苗的研究进展有一个全面的认识。

　　1　狂犬病病毒

　　狂犬病病毒是一种弹状的有蛋白质囊膜包裹的RNA弹状病毒。狂犬病病毒属目前包含7种血清型，都具有相似的基因组结构。狂犬病病毒以及类似病毒为不分节段、抗致敏作用、单链RNA，基因组大约为12 kb。由50个核苷前导序列以及编码5种蛋白[核蛋白(nucleo protein，NP)、磷蛋白(phosphoprotein，NS)、包膜基质蛋白(matrix protein，MP)、表面糖蛋白(glycoprotein，GP)和转录酶蛋白(1arger protein，LP)]的5种基因组成[3]。

　　表面糖蛋白以10 nm的突起覆盖病毒包膜。包膜基质蛋白包在包膜表面。核蛋白包裹着病毒RNA，形成核糖核衣壳，以螺旋形缠绕在中心。磷蛋白和转录酶蛋白与核糖核衣壳联合，组成RNA依赖的RNA聚合酶。糖蛋白构成病毒表面突起，是RV与细胞受体相结合的部位，又是有效的保护性抗原，能诱导产生中和抗体并刺激细胞免疫。核蛋白是病毒的主要内部结构蛋白，也是病毒组成中最保守的结构蛋白，在不同毒株之间变异较小[4]。近年来有大量报道对糖蛋白或核蛋白基因进行克隆，构建基因工程亚单位蛋白或重组质粒，并用重组蛋白或质粒免疫动物，多数产生了抗狂犬病病毒抗体，说明这些重组蛋白或质粒作为基因疫苗的潜在应用价值[5]。

　　2　症状及诊断

　　狂犬病呈现两种形式，一种反应剧烈，一种反应症状不明显。狂犬病典型临床症状先以发热、恶心、头痛、乏力以及厌食为主，随后出现很多奇异的行为，如极度攻击性、失眠、听觉或视觉刺激而激动、唾液分泌过多、肌肉抽搐、痉挛、恐水，并有咬伤和咀嚼倾向，最后是昏迷和瘫痪阶段，会因突然心力或呼吸衰竭而死亡。

　　狂犬病很难进行诊断，单一检测结果不能作出判断。新鲜组织上获得单一检测阴性结果，不能排除感染的可能性，必须同时进行乳鼠脑内接种试验或者细胞培养分离病毒方法[6]作对比。实验室诊断方法包括下列几项：荧光抗体实验(fluorescent antibody test，FAT)，快速狂犬病酶免疫诊断法(rapid rabies enzyme immunodetection，RREID)，小鼠颅内接种分离狂犬病病毒法(MIT)、细胞培养分离技术(cell culture isolation techniques，CIT)等。

　　3　狂犬病疫苗的研究

　　目前，用于人和动物狂犬病预防主要使用的是常规疫苗，常规疫苗尽管安全有效，但存在一些缺点。随着分子病毒学和疫苗学的发展，研制安全、有效、经济、使用方便的狂犬病新型疫苗已成为当前开发的活跃领域。目前已经和正在研制开发的狂犬病新型疫苗主要有亚单位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、活载体疫苗、基因缺失疫苗、抗独特型疫苗、转基因植物可食疫苗等。下面就近年来国内外有关方面的研究进展进行综述。

　　3.1　亚单位疫苗

　　亚单位疫苗可以分为化学亚单位疫苗和基因工程亚单位疫苗。狂犬病化学亚单位疫苗是从全病毒中提取病毒糖蛋白成分，Perrin P等[7]通过正辛基 β D吡喃葡萄苷裂解狂犬病病毒糖蛋白，然后将糖蛋白嵌入脂质体，形成具有40 nm～70 nm长的向外突起的颗粒状免疫体，接种动物后可诱生高水平的中和抗体，能够保护动物对街毒的攻击。若将G蛋白包在脂质体内而不是嵌在表面，其免疫作用并无明显提高。用皂甙与G蛋白制备成免疫刺激复合物，不仅较氢氧化铝制成的G蛋白亚单位疫苗免疫效果好，而且安全并能诱导细胞免疫。但是存在的问题是从完整病毒粒子中获取病毒的有效成份制备亚单位疫苗，抗原量有限，成本高，且提取困难，提取过程可能会破坏糖蛋白本身的空间构象而达不到预期免疫效果。在此基础上，还可将分离得到糖蛋白经溴化氢裂解，产生Cr1、Cr2…Cr7等7个片段，其中有3个片段可以产生中和抗体，这种疫苗称之为多肽疫苗。亚单位疫苗和多肽疫苗，都是病毒颗粒上的一部分，都不含有病毒的基因成分，因此非常安全，但是它们的免疫原性较低，需要与佐剂或载体偶连应用[8]。

　　基因工程亚单位疫苗方面，Lafon等从CVS株克隆糖蛋白基因，切除糖蛋白cDNA的信号肽序列，经质粒pBR322转化大肠埃希菌形成菌落库。设计了不同长度糖蛋白的编码序列并构建了表达载体，转化大肠埃希菌后表达出多种蛋白。这些基因工程多肽虽然都不同程度与天然糖蛋白抗血清发生反应，但结合抗糖蛋白抗体的能力仅为糖蛋白的2%～3%，且免疫原性差。Lathe等用噬菌体M13作载体在大肠埃希菌中表达了狂犬病病毒的G蛋白抗原，此后又有许多人通过改造表达载体和大肠埃希菌的表达特性来表达狂犬病糖蛋白或膜外区或主要的抗原表位，但获得的免疫结果很差。试验证明G蛋白在大肠埃希菌中以变性形式存在，G蛋白诱导机体的免疫应答严格依赖于完整的二级和三级结构。

　　Klepfer S R等将SAD株全长GP基因亚克隆带进启动子的酵母表达质粒，利用酵母表达系统表达狂犬病病毒糖蛋白。利用酵母表达系统，表达的糖蛋白量很大，也能进行糖基化修饰，但糖基化位置和糖基化的类型会与天然蛋白存在差异，从而影响其免疫原性，因此此种方法制备狂犬病病毒亚单位疫苗效果有限。

　　现已成功的用真核表达系统表达了狂犬病病毒G蛋白和N蛋白，加佐剂后接种动物可诱导对狂犬病病毒的免疫，可有效诱导小鼠产生对狂犬病病毒的细胞免疫和体液免疫，并抵抗致死剂量狂犬病街毒的攻击。但是哺乳动物细胞表达的亚单位疫苗，生产工艺复杂、耗时、成本高，而且表达水平偏低，因此限制了它的研究应用。

　　Fu Z F等[9]将杆状病毒表达的糖蛋白纯化后免疫动物，研究表明，杆状病毒表达的狂犬病病毒糖蛋白经口服免疫接种，诱导浣熊产生了中和抗体，并能抵抗狂犬病强毒株的攻击。

　　3.2　合成肽疫苗

　　目前关于狂犬病合成肽疫苗的研究，包括了大部分糖蛋白的主要抗原表位区，合成的多肽有6个～36个氨基酸残基。但免疫小鼠后中和抗体水平不高。新一代的合成肽疫苗由狂犬病病毒T细胞表位和糖蛋白中和性表位组成，但体内多次免疫不会产生高水平抗体，但一旦机体受病毒攻击，就有初次免疫效应和一定的免疫保护作用[10]。目前合成肽疫苗离实际应用的差距还较大，但研究前景较为广泛。

　　3.3　DNA疫苗

　　DNA疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗，是将编码某种抗原蛋白的基因置于真核表达元件的控制之下，构成重组质粒DNA，将其直接导入动物机体内，通过宿主细胞的转录翻译系统合成抗原蛋白，从而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。基因疫苗能诱导产生细胞和体液免疫，能够刺激产生较强和较持久的免疫应答，可以将含有不同抗原基因的质粒混合起来进行联合免疫，可以反复使用，因此基因疫苗成为新型疫苗发展的热点。

　　在狂犬病基因疫苗研究方面，1994年Wistar研究所Xiang Z Q等[11]将编码狂犬病病毒糖蛋白的cDNA插入SV40启动子下游，构建狂犬病病毒的DNA疫苗，直接注射小鼠腓肠肌，免疫3次，间隔2周～3周，每次150 μg。免疫后小鼠产生了抗狂犬病病毒中和抗体、抗狂犬病病毒糖蛋白特异性CTL和分泌淋巴因子的Th细胞，用5倍LD50剂量的狂犬病病毒CVS株攻击，均获得保护，而对照组小鼠14 d内全部死亡。Lodmell D L等[12]把带有G基因的DNA包被在2.6 μm金粒上，用基因枪免疫小鼠，初免及加强免疫后均可检测高滴度的抗体，并持续300 d,315 d后用致死量的狂犬病病毒攻击，小鼠全部存活。Ray N B等用单磷脂质A作为免疫刺激物，皮下免疫小鼠，可以提高DNA疫苗的免疫应答。Lodmell D L等用MPL作DNA疫苗的佐剂，比较了不同途径的免疫接种，发现用MPL初次免疫的小鼠，皮下及肌肉接种，中和抗体的滴度明显高于无佐剂的DNA疫苗，加强免疫后，未用佐剂组高于用佐剂组、基因枪免疫组，其抗体滴度继续升高。Xiang Z Q等用鼠粒细胞噬菌体集落刺激因子与狂犬病病毒DNA疫苗共同免疫，可提高体液免疫和细胞免疫应答水平。

　　在我国，扈荣良等[13]首先将狂犬病病毒糖蛋白G基因插入PMTOIO/A＋表达载体中，肌肉免疫小鼠后，能产生抗狂犬病病毒的抗体，对狂犬病病毒强毒攻击有一定的保护作用。李萍等[14]将狂犬病病毒G基因重组到质粒PRC/CMV中，免疫小鼠可产生低滴度的中和抗体，对狂犬病病毒强毒攻击有一定的保护作用。

　　基因疫苗虽然有众多优势，但是基因疫苗可能存在的安全性问题是，外源基因导入体内后，可能与细胞染色体基因组发生整合，从而导致细胞转化、癌变，但迄今尚未发现有整合的证据。此外，目前存在的主要问题是引发的免疫应答反应，经常达不到预期水平。原因是外源目的基因真正进入细胞特别是细胞核的量少，不能表达出足够量的免疫原。

　　3.4　基因重组狂犬病病毒减毒疫苗

　　与灭活疫苗相比较，减毒活疫苗可以诱导强的细胞毒性T细胞(CTL)介导的免疫反应，而灭活疫苗不能诱导T细胞免疫。狂犬病病毒为负链RNA病毒，不能直接对其基因组进行基因操作，但随着反向遗传学技术的发展，对狂犬病病毒结构基因有了深入了解，同时也为基因缺失或重组疫苗研究提供了基础。研究发现糖蛋白、基质蛋白、核蛋白、转录大蛋白的缺失重组毒都不适合作为疫苗候选株，但是该重组病毒的增殖滴度不高。Morimoto K等[15]通过细胞系反式技术，构建了磷酸化蛋白基因缺失重组病毒，该重组病毒可以提供长期的免疫保护。此外，Hosokawa M J等[16]技术通过反向遗传构建了携带双糖蛋白基因的重组狂犬病病毒，同母源病毒RC HL株相比，细胞生长特性几乎相同，但是糖蛋白表达量是母源病毒的1.5倍。小鼠免疫试验证明该重组病毒比母源病毒具有更高的免疫原性，该重组病毒可以作为新的狂犬病灭活疫苗株。

　　基因缺失疫苗在生产过程和生产成本上不存在问题，关键是实际应用中的安全性。因为病毒在自然状态下可能与野毒株发生重组，或者发生核酸修补，使疫苗株原来缺失的基因恢复而重新获得毒力。

　　3.5　重组活载体疫苗

　　应用无病原性或弱毒疫苗株病毒和细菌作为载体，插入外源性保护基因，构建重组活载体疫苗。由于外源基因已是载体病毒或载体细菌“本身”成分，其所引起的免疫应答，常不低于完整病毒或细菌相应成分引起的免疫强度，而且各成分之间一般不发生相互干扰或排斥现象，又因可以同时插入几个外源基因，故是当前认为最有开发和应用前景的动物疫苗。

　　3.5.1　痘病毒载体疫苗　1984年Keiny等首先将狂犬病病毒ERA的G基因重组到痘苗病毒Copenhagen株中获得表达。Eposito等则将接近街毒的CVS株的G基因重组到毒力更弱的痘苗病毒NYBH株中进行了表达。Summer等构建了表达N基因的痘苗病毒Copenhagen株重组体，证明可诱导小鼠和犬对狂犬病病毒的免疫，并能获得对致死剂量病毒的攻击的部分保护。Eposito还将CVS株G基因重组到浣熊痘病毒中，用这种重组病毒给浣熊和羊口服可诱导高水平中和抗体的产生，并抵抗致死剂量街毒的攻击。用构建的R的表达N基因或G基因的重组浣熊痘病毒，证明可有效诱导小鼠产生对狂犬病病毒的细胞免疫和体液免疫，并抵抗致死剂量狂犬病街毒的攻击[17]。

　　3.5.2　腺病毒载体　1990年应用基因重组技术将ERA株糖蛋白重组于人腺病毒5型中，得到了表达狂犬病病毒糖蛋白的AdRG1，经口服免疫小鼠、狐狸、臭鼬等动物和经鼻腔免疫犬均可诱生高水平的中和抗体，保护动物抵抗致死剂量狂犬病病毒的攻击，表明可应用于不同种属的动物。另外，将G基因插入人腺病毒5型E1A区构建的复制缺损型的重组腺病毒，经皮下、口腔和呼吸道等途径接种小鼠发现经皮下、呼吸道接种可诱导中和抗体和细胞毒性T细胞的产生，且能有效抵抗狂犬病病毒的攻击。Zhou D等[18]构建了表达狂犬病病毒糖蛋白的黑猩猩腺病毒，该病毒可以作为口服疫苗，提供黏膜免疫，保护机体免受狂犬病病毒从黏膜途径实现感染。

　　由于犬及犬鼬科野生动物是狂犬病的主要贮存宿主，因此以犬腺病毒作为载体，构建狂犬病重组疫苗意义更大。同时犬腺病毒其宿主范围广泛，毒株稳定，安全可靠。本实验室在前期工作中获得的表达狂犬病病毒保护基因的重组犬2型腺病毒，在犬科动物取得了良好的免疫效果。

　　3.5.3　疱疹病毒载体疫苗　Otsuka等将糖蛋白基因插入犬疱疹病毒(CHV)TK基因内部，细胞内同源重组构建出重组病毒。该重组病毒在侵染MDCK细胞后可正确表达出G蛋白，免疫试验显示，将这种能表达G蛋白的重组CHV经鼻腔给狗接种后，所产生抗狂犬病病毒的中和抗体的滴度要高于常规灭活狂犬病疫苗。

　　3.6　转基因植物口服疫苗

　　目前，狂犬病病毒糖蛋白已在番茄、烟草中得到表达。由于植物表达系统的特殊性，在构建糖蛋白基因表达盒时，往往在糖蛋白N端融合的植物特异性信号肽，促进蛋白的分泌表达。小鼠免疫试验表明，口服该种转基因植物，可以产生抗狂犬病的中和抗体[19]。另有研究将狂犬病病毒糖蛋白重组植物病毒，然后感染菠菜，通过口腔喂食免疫小鼠，结果同样可产生相应的免疫反应[20]。总的来讲，狂犬病病毒糖蛋白目前在可食性植物中的表达水平还相当低，但是，一旦表达水平方面的技术障碍得到克服，这将为生产安全有效的狂犬病疫苗提供广阔的前景。

　　4　结语

　　由于狂犬病病毒宿主范围广，能够感染所有哺乳动物，并且呈全球分布，因此仍然是一个重要的健康问题。狂犬病呈地方性流行，在种群之间传播，每年都有成千上万的人死于狂犬病。一旦狂犬病病毒在特定的动物群体中产生，疾病传播可流行几十年。由于人们对狂犬病病毒与健康有关的信息不了解，它们扩散范围有可能有变化，并且出现新的病毒株。最近在澳大利亚发现pteropid狂犬病病毒，是第7种血清型，狂犬病病毒对动物和人类健康构成重新出现的威胁[20]。由于安全的人用狂犬病疫苗价格昂贵，并且野生动物中狂犬病增加，世界范围内广泛需求具有免疫原性高、安全、易于生产、具有较长保护期的疫苗。所以，对狂犬病病毒不断地进行研究，进一步提高对该病的认识，有助于找到预防和免疫该病的新方法。

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