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饲料中喹乙醇含量高效液相色谱法检测研究进展

王亚吨 邓国东 吴荔琴

（广东省兽药与饲料监察总所，广东 广州，510230）

喹乙醇（Olaquindox），又名喹酰胺醇，化学名为N-羟乙基-3-甲基-乙-喹啉酰胺-1，4-二氧化物，商品名倍育诺，快育灵。喹乙醇为一种化学合成喹恶啉类广谱抗菌药物，其抗菌作用强，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用。喹乙醇还具有蛋白同化作用，可提高饲料转化率与瘦肉率，促进动物生长。上世纪80年代农业部批准喹乙醇作为兽药使用，并核发喹乙醇和5%喹乙醇预混剂产品批准文号。

　　喹乙醇的毒性随动物种属不同存在较大差异，特别对家禽和鱼类，有中度至明显蓄积毒性和一定遗传毒性，对部分鱼类有明显致畸作用【1】。农业部批准的喹乙醇兽药国家标准（《中华人民共和国兽药典》）明确规定，喹乙醇作为抗菌促生长剂，仅用于35公斤以下猪的促生长，以及防治仔猪黄痢、白痢及猪沙门氏菌感染，休药期35日；禁用于体重超过35公斤以上猪和禽、鱼类等其他种类动物。

　　合理使用喹乙醇，可以预防和治疗动物疫病，促进养殖业的发展，使用不当、使用过量或违规使用，其副作用和毒性将直接造成动物的群体危害。近年来，喹乙醇超范围滥用现象蔓延，家禽喹乙醇中毒事件时有发生，水产养殖环节发生大面积死鱼事件[2]。虽然猪对喹乙醇远不如鸡、鸭那么敏感，但若配合饲料中添加量超过200mg/kg，亦会导致中毒[3]。此外，喹乙醇超剂量应用还会增加其在动物组织中的残留量，从而增大细菌耐药性或对人的身体健康造成危害，

　　为加强喹乙醇安全监管，有效打击违规作用喹乙醇行为，保障畜牧业和水产养殖业健康发展，确保畜禽产品和水产品质量安全，十分有必要开展饲料中喹乙醇检测。

1、喹乙醇的药物性质

　　喹乙醇的化学名为N-羟乙基-3-甲基-乙-喹啉酰胺-1，4-二氧化物，化学结构式见图1。为浅黄色结晶粉末；无臭，味苦。熔点：207～213℃。在热水中溶解，在冷水中微溶，在甲醇、乙醇和氯仿中几乎不溶。喹乙醇固体性质稳定，在光照下极易分解，样品应避光保存。

图1 喹乙醇的结构式

2、样品前处理

　　样品前处理的目的是将饲料中的喹乙醇提取出来，并使其与饲料中其他成分分开，通常包括样品提取与样品净化。

2.1、样品提取

　　提取溶液的选择对饲料中喹乙醇分析至关重要。喹乙醇见光易分解，故在操作过程中应尽量避光，容器应尽量使用棕色容器或用黑色胶袋套住。根据喹乙醇微溶于水，易溶于热水，难溶于甲醇等普通有机溶剂的特性，目前有采用5%甲醇【5，6、18、19】、15%甲醇【8】、20%甲醇【11，13】、40%甲醇【12】、50%甲醇【4，7，14】、70%甲醇[21]、丙酮-碳酸钾(50 g/L)水溶液【9，15】、DMF【10】、乙腈【17】、甲醇-乙腈-水混合提取液【20】等提取液以超声及热水浴【4、8、9、10、12、】或振荡【5、6、7、11、13、14、16、17】方式提取的报道。

　　廖峰等[18]以含0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、100%不同的甲醇与水的配比提取，考察饲料中喹乙醇添加回收率时发现5%甲醇水提取效率较其他配比高。李来生[10]发现当提取液中水含量较高时，提取液顔色明显偏深，水溶性杂质多，在色谱分析时其前组分峰较多，且峰形大。有机溶剂增多时，其前组分峰多，后组分峰也增多。欧阳华学等[7]实验表明采用纯的有机溶液提取时分析，其峰形出现展宽或不规则现象，采用甲醇-水提取法的色谱图，喹乙醇色谱峰为尖锐对称峰且喹乙醇与饲料中其它杂质达到基线分离。在提取液中加入碳酸钾【6、9、14、16、17】，可沉淀溶液中的矿物质，消除酸性杂质的干扰，避免溶液中矿物离子过多而影响色谱分离效率。

　　已有的试验结果表明样品的萃取溶剂的强度不仅影响其组分的回收率，同时也影响组分的色谱分离状况，若采用洗脱强度较大的溶剂如纯甲醇或乙腈溶解样品，则会使色谱峰展宽。

2.2、样品净化

　　陈红、李来生等【7、13、17】在样品提取液中加入正已烷，以去除饲料中可能干扰检测的脂类物质。李来生在1997年认为饲料中喹乙醇检测用固相萃取法进行净化，其回收率低，这可能与当时固相取技术发展尚不够有关。近年来报道有采用中性氧化铝柱、HLB固相萃取小柱、PEP净化小柱对饲料提取液进行净化，可有效去除净质，解决药物峰与基质有效分离，并为饲料中喹乙醇进行质谱确证创造了条件。杨文军【19】使用OASIS HLB固相萃取取进行净化， HLB柱先用3mL甲醇和3mL水活化，取提液过柱，分别用0.02mol/L盐酸溶液和5%甲醇溶液作为淋洗液，40%的甲醇溶液作为洗脱液，结果表明绝大部分杂质被净化掉，尤其是水溶性杂质。贾涛[22]则用PEP固相萃取小柱代替OASIS HLB固相萃取小柱，用10%乙酸乙酯-甲醇作洗脱液，洗脱液吹干后，用流动相复溶。金晓峰【21】使用中性氧化铝柱对饲料提取液进行净化，即用70%甲醇溶液提取离心后过中性氧化铝柱进行净化，可有效去除饲料中的杂质。

3、检测条件

3.1 检测波长

　　通过紫外分光光度计或使用二极管阵列检测器对喹乙醇标准溶液进行扫描，喹乙醇在260nm和370nm附近均有特征吸收峰。在已有的报道中，检测波长在260nm附近的有260nm【6，10，11，14】、262nm【12】，选择370nm附近的有368 nm 【9，15】、370 nm【8，16】、375nm【4，13】、380nm【5，7，17】。260nm波长附近的信号比370nm波长附近强一倍，但在260nm波长下检测时，由于受饲料中复杂成分的影响，提取液在没经净化的情况下，杂峰干扰较在370nm波下大，即260nm附近吸收峰的灵敏度较高，在370nm附近吸收峰的选择性较好。检测波长的选择，应当依据待测样品及实验条件进行选择。

3.2 流动相

　　喹乙醇的分子结构中含有酰胺键、醇羟基以及电负性较强的氧元素，因此与水、醇有较强的氢键结合力，甲醇、乙腈、水是较理想的流动相。已报道的流动相体系有：10%甲醇【7】、甲醇/水15/85(V/V)【4，6，8，11，13，17，19】、0. 02 mol/L磷酸-甲醇(85∶15)【5】、甲醇/水15/85(V/V，磷酸调pH到2.7)【14】、甲醇/水15/85(V/V，乙酸调pH到2.2)【16】、甲醇/水15/85(V/V，乙酸调pH到2.6)【21】、20%甲醇【10】、25%甲醇【9，15】、0. 01 mol/L磷酸-甲醇(70∶30)【18】、40%甲醇【12】、磷酸盐缓冲液-乙腈-甲醇 （55：25：20）【20】，杨文军等[19]则以甲醇和水进行梯度洗脱，提高了检测灵敏度和分离度，使峰形得到改善。

　　欧阳华学[7]在试验中分别考察了甲醇-水体系和乙腈-水体系对饲料中喹乙醇的分离情况，在甲醇-水体系中甲醇与水的配比对喹乙醇与饲料中其它组分的色谱分离有明显影响，当流动相中甲醇含量大于30%( )时，出峰时间太短，样品中喹乙醇与其它组分难以分离，当流动相中甲醇含量小于5%时，喹乙醇出峰时间较长，且拖尾。在实验中,也曾试验过乙腈-水体系，结果发现在流动相中加入乙腈对饲料中喹乙醇的分离度无明显改善。李来生[10]也认为甲醇含量对喹乙醇分离度影响较大，当流动相中甲醇含量高于28%时，组分与前干扰峰分离度变差；而低于15%时，分析时间延长，且喹乙醇峰拖尾现象严重，峰形不好。李来生[9]认为流动相中酸度对喹乙醇分析影响较少，卢春香[14]、刘发全[20]等却认为流动相中pH值的改变对溶质分离有实质性影响，理论上流动相中pH值的改变可能影响出峰时间，并进而影响分离率。

3.3 色谱柱

　　目前饲料中喹乙醇分析使用的色谱柱多为C18柱，仅一编报道使用C8柱[10]。除非流动相的pH值对柱子的选择可能有所要求外，用普通的C18柱，选择合适的甲醇与水（或缓冲液）的比例均可避开杂质，达到与杂质分离效果。

3.4 柱温

　　柱温对液相色谱分析的出峰时间有影响，温度升高，喹乙醇出峰时间提前。已有报道大多选择室温作为柱温。当高效液相色谱仪带有柱温箱时，为保证出峰时间不随室温的变化而变化，应设定合适的柱温。

4、结语

　　依据喹乙醇的化学特性，优化提取条件和净化方式，选择合适的流动相和检测波长，可有效测定饲料中的喹乙醇含量，为监测喹乙醇的滥用提效技术支持。

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摘自《广东兽药》2012年第2期

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